硝酸盐是天然水体中无处不在的污染物质，其浓度过高是诱发水体富营养化的重要因素之一。为进一步降低污水氮含量，恢复受纳水体的自净功能，我国污水排放标准中有关含氮污染物的排放标准愈发严格，如《生活饮用水卫生标准》规定硝酸盐氮最高限值为10 mg・L−1。异养反硝化和自养反硝化工艺是常用的硝酸盐生物去除途径，与传统的异养反硝化相比，硫自养反硝化工艺因具有无需外加碳源、运行成本低、污泥产量少等优点而逐渐在深度脱氮研究领域受到关注。但硫自养反硝化过程会产生大量H+与硫酸盐，需通过加入石灰石或其他碱度物质进行中和，导致出水硬度大幅增加。因此，SAHINKAYA等研究了异养自养联合反硝化过程，此过程中异养与自养反硝化同时进行，前者生成的碱度可供后者消耗，出水呈中性，并降低了硫酸盐积累量。
木屑作为反硝化的固体缓释碳源，在实际工程中已有成功应用。以木屑为缓释碳源的异养反硝化工艺具有使用寿命长、硝酸盐去除率高和维护成本低等优点。但迄今为止未见以木屑-硫磺混合物为填充床的反硝化连续流反应器及工艺研究，其连续流工艺的可行性及其长期运行的稳定性有待考察。木屑-硫磺填充床反硝化生物滤池采用单质硫和木屑作为滤料，除具有截留悬浮污染物的功能外，木屑-硫磺复合滤料可以在生物滤池中同时进行产生酸度的硫自养反硝化以及产生碱度的异养反硝化过程，通过两者优化复配比例和调节进水参数，在获得稳定的硝酸盐去除率的同时，可以将反应体系的pH维持在中性范围。相比外加有机碳源的反硝化滤池，木屑-硫磺填充床反硝化生物滤池无需投加有机碳源，可有效避免二次污染。同时，木屑-硫磺填充床反硝化滤池，污泥产率低，可有效降低反冲洗频次，且硫磺和木屑均为廉价载体，因此具有明显的成本及运行优势。
本研究根据二级出水可利用碳源不足的水质特点，以木屑、硫磺为混合填料，设计木屑-硫磺填充床反硝化生物滤池，考察木屑-硫磺填充床反硝化生物滤池对硝酸盐的去除效果，确定其最佳运行条件，探究其反硝化脱氮效能。以期为碳氮比失衡的污水处理厂二级出水深度脱氮提供技术参考。
1 实验部分
1.1 木屑-硫磺填充床的构建
本实验所采用的反应器如图1所示，其材质为有机玻璃，反应器内径160 mm，总高度370 mm，反应区高250 mm，有效体积2.45 L，沿柱高均匀设置4 个取样口，底部设置压力表。木屑置于鼓风干燥箱(DHG-9140A)中烘干24 h后取出，与硫磺颗粒(粒径8~12 mm，中国石油化工有限公司)按1:1的质量比混匀进行填充。为防止启动阶段木屑随出水流失，反应器填充层底部和上部均填充3 cm厚的硫磺。
滤池接种污泥为实验室驯化成熟的异养反硝化与自养反硝化污泥的混合液(600 mL，体积比1:1)，启动阶段HRT为12 h，进水组成：NO3−-N 30 mg・L−1、NH4+-N 2 mg・L−1、TP 1 mg・L−1、NaHCO3 0.1 g・L−1、微量元素溶液1 mL・L−1。反应器在室温(23±3) °C条件下运行，每天检测出水中NO3−-N浓度，NO3−-N去除率达到50%以上，反应器启动成功。
图1 实验装置示意图
1.2 实验设计
实验分为2部分：第1部分是木屑浸出液分析，称取10 g经24 h干燥后的木屑置于500 mL锥形瓶中，加入500 mL去离子水，每日更换锥形瓶中的水，取出水测定其COD与VFA;第2部分为木屑-硫磺填充床反硝化生物滤池脱氮效能的研究，在不同HRT条件下(HRT=6 h(Ⅰ)、8 h(Ⅱ)、10 h(Ⅲ)、12 h(Ⅳ))探究木屑-硫磺填充床反硝化生物滤池对硝酸盐的去除效果以及亚硝酸盐、硫酸盐的积累情况。同时考察反应器出水COD及进出水pH的变化，分析经木屑-硫磺填充床反硝化生物滤池处理的二级出水是否含有过量的残留有机物。考察木屑-硫磺填充床反硝化生物滤池中是否发生硝酸盐异化还原(DNRA)作用。
1.3 实验水质及分析
反应器进水模拟城镇污水处理厂二级出水。使用自来水配制进水，其中各物质浓度为NO3−-N 30 mg・L−1、NH4+-N 2 mg・L−1、TP 1 mg・L−1、NaHCO3 0.1 g・L−1、微量元素溶液1 mL・L−1，进水硫酸盐浓度始终未超过10 mg・L−1。实验所用药品均为分析纯，全部购自于天津东丽区天大化学试剂厂。
水样先经0.22 μm滤膜过滤，VFAs通过气相色谱仪(7890N Agilent Tec.Co)测定;NH4+-N通过纳氏试剂分光光度法测定;NO3−、NO2−、SO42−通过离子色谱仪(戴安ICS3000)测定;COD通过快速消解分光光度法测定;pH通过便携式pH计测定。
2 结果与讨论
2.1 木屑浸出液分析
木屑浸出液的COD及VFA浓度变化如图2所示。结果表明，前10 d内浸出液中COD与乙酸浓度较高，最高达到323 mg・L−1与106.1 mg・L−1，丙酸只在第1~6 天和第8 天的浸出液中检出，平均浓度为(10.9±1.5) mg・L−1。但此阶段COD与VFA的浓度呈明显下降的趋势，VFA在浸出液COD中所占比值逐渐上升，从第1 天的32.8%增大到第9 天的43.7%。其原因是木屑表面大量可溶性有机物溶于水中，而后木屑本底有机物被缓慢释放，而其中VFA的分子质量又相对较低，使得浸出液COD逐渐下降。李乐乐等在玉米秸秆释碳研究中发现，玉米秸秆释放COD规律呈现出前期较快、中期下降、后期稳定的规律，且认为前期COD大量释放是玉米秸秆表面溶解性有机物溶于水中所致。钟胜强等在研究不同植物材料释碳性能时也认为，初期水解液COD迅速升高与材料中水溶性碳水化合物快速溶解有关。这都与本实验得出的结论相符。
图2 木屑COD及VFA释放规律
第10 天以后，木屑释放COD与VFA的速率趋于稳定，直至第30 天，仍有19.9 mg・L−1的乙酸析出，30 d内，COD中(40.6±10.0)%是反硝化菌可直接利用的VFA。研究表明，以VFA为碳源时的反硝化速率高于以甲醇、乙醇为碳源时的反硝化速率，且以乙酸为碳源时反硝化速率最高，混合VFA碳源的反硝化速率更是高于组成它的单一VFA的反硝化速率。而浸泡于水中的木屑恰好可以长时间稳定地释放出VFA，证明了木屑作为异养反硝化碳源物质的可行性。.污水宝或参见更多相关技术文档。
2.2 水力停留时间的影响
2.2.1 水力停留时间对硝酸盐去除的影响
由图3(a)可知，HRT=6 h时，硝酸盐去除率在50%左右，从进水的(30.6±0.4) mg・L−1下降至(14.7±0.3) mg・L−1;HRT=8 h时，硝酸盐去除率略有提高，从进水的(30.6±0.2) mg・L−1下降至(13.6±0.2) mg・L−1;HRT=10、12 h时，硝酸盐去除率最高，可达60%以上，分别从进水的(30.5±0.3)、(30.8±0.6) mg・L−1下降至(11.5±0.1)、(11.8±0.1) mg・L−1。在2.1中已发现木屑释放碳源呈现出先快后慢的规律，而反应器运行启动初期的第1~10 天正是木屑碳源释放速率最快的阶段。而后木屑释放的碳源速率趋于稳定，反硝化菌可直接利用的VFA含量下降。因此，反应器经过启动阶段之后的硝酸盐去除率明显下降，由启动阶段的78.2%降至63.4%。
王淑莹等研究发现，溶解氧会抑制硝酸盐还原菌酶系统的合成从而抑制硝酸盐还原酶的产生，而溶解氧对亚硝酸盐还原菌的抑制作用更要大于硝酸盐还原菌。反应器中反应区高度仅为250 mm，由于上流进水中存在的DO持续进入反应器，在反应区中下部抑制硝酸盐还原酶的生成从而使反硝化速率下降。并且启动阶段过后，未经特殊处理的木屑释放VFA的速率已基本稳定，其表面富集的水解菌所产生的可利用碳源也不充足，难以使脱氮效率维持在较高的水平。
图3 不同HRT下的脱氮效能
2.2.2 水力停留时间对亚硝酸盐积累的影响
由图3(b)可知，HRT=6、8 h时，出水亚硝酸盐浓度较高，分别达到(1.6±0.1)、(1.6±0.0) mg・L−1;HRT=10、12 h时，出水亚硝酸盐浓度下降，分别为(1.4±0.0)、(1.4±0.0) mg・L−1。这主要是因为，反硝化过程中硝酸盐首先被硝酸盐还原酶转化为亚硝酸盐，而后再由亚硝酸盐还原酶最终还原为氮气。亚硝酸盐是反硝化过程中的中间产物，自养反硝化中，当硝酸盐浓度低于500 mg・L−1时，微生物在降解亚硝酸盐的同时生成亚硝酸盐还原酶，会加快亚硝酸盐的降解速度[22]，而进水硝酸盐浓度远低于这一抑制水平。杨莎莎等发现进行亚硝酸型反硝化的最佳pH在7.7~8.6之间，即以弱碱性条件为宜，反应器内部pH始终处于中性范围，影响了亚硝酸型反硝化的彻底进行。熊剑锋等[24]以梧桐树叶浸出液为反硝化碳源进行研究时发现，由于溶解氧始终处于1 mg・L−1以下，COD/N越小，亚硝酸盐去除率越差。可知木屑在稳定运行阶段所释放的可利用碳源含量不足以支持亚硝酸盐的完全还原，产生了少量亚硝酸盐的积累。并且HRT过短时，亚硝酸盐转化为氮气的反应时间不足，反硝化过程无法完全进行，从而导致亚硝酸盐产生积累。HRT=12 h时，无论是硝酸盐的去除率还是亚硝酸盐的积累量均与HRT=10 h时无较大差别，可知最佳水力停留时间为10 h。
2.2.3 水力停留时间对硫酸盐积累的影响
由图4可知。不同阶段硫酸盐的生成量分别为(65.5±0.9) mg・L−1(Ⅰ)、(61.5±0.6) mg・L−1(Ⅱ)、(58.9±0.4) mg・L−1(Ⅲ)、(59.1±0.4) mg・L−1(Ⅳ)，呈现逐渐降低的趋势。OH等研究表明，异养自养联合反硝化中自养与异养反硝化所占的比重可通过硫酸盐的生成量间接确定。根据硫自养反硝化中硝酸盐与硫酸盐的化学计量数为1:1.1计算可得相应的硫自养反硝化所占的比例分别为(54.9±1.3)%(Ⅰ)、(48.2±1.2)%(Ⅱ)、(41.1±0.8)%(Ⅲ)、(41.2±1.2)%(Ⅳ)，结果表明硫自养反硝化所占的比例逐渐下降。这是由于厌氧条件下硫酸盐还原菌可以使硫酸盐还原，这种异化过程以有机物为电子供体，最终生成H2S。同时，除硫酸盐外，硫自养反硝化过程中还会产生亚硫酸盐、硫代硫酸盐等中间产物。而兼性自养反硝化菌可以利用各种含硫化合物作为能量来源以适应不同的营养环境。出水中未检出硫代硫酸盐也印证了以上说法。所以，由生成的硫酸盐间接确定的自养反硝化在联合反硝化中所占的比例可能低于实际情况。木屑-硫磺异养自养联合反硝化体系不会产生较高的硫酸盐积累量，且HRT=10 h时硫酸盐的积累量与HRT=12 h时相差不大，可确定反应器最佳水力停留时间为10 h。
图4 不同HRT下硫酸盐的积累量
2.3 出水氨氮的变化
LI等在进行木屑-硫磺异养自养联合反硝化实验时发现，由于硝酸盐异化还原(DNRA)作用，木屑-硫磺异养自养联合反硝化过程会积累大量氨氮，最高可达2 500 mg・L−1。因此，需考察连续流条件下木屑-硫磺填充床反硝化生物滤池出水中是否存在氨氮积累。由图5可知，连续流条件下木屑-硫磺填充床反硝化生物滤池出水中无氨氮积累，氨氮去除率可达100%。周少奇等发现在有机碳源存在的条件下，厌氧氨氧化与反硝化反应能同步进行，二者之间会产生相互促进作用。厌氧氨氧化是指在厌氧或缺氧条件下，厌氧氨氧化菌以NO2−-N为电子受体，将NH4+-N氧化为N2的生物过程。反应器中有可能发生了厌氧氨氧化反应，实现了NO2−-N与NH4+-N的同步脱除，而未发生硝酸盐异化还原(DNRA)作用，因而对氨氮具有较好的去除效果。同时说明稳定运行的反应器中不会存在NO2−-N的过量积累。
图5 不同HRT下氨氮的变化
2.4 出水COD的变化
由图6可知，在反应器启动阶段，木屑大量释放碳源，硝酸盐去除率较高，但出水中也含有诸如木质素、纤维素等微生物暂时无法利用的碳源物质，使得出水COD浓度最高达到116.6 mg・L−1，而后出水COD浓度逐渐下降。第12 天至启动阶段结束，硝酸盐去除率趋于稳定，出水COD下降至45.5 mg・L−1。第16 天之后，出水COD继续下降，至第24 天起，出水COD浓度再未超过30 mg・L−1。孙雅丽等以腐朽木为反硝化碳源进行研究时发现反应体系内部已经形成了一个水解菌与反硝化菌共存的微生物群落，在群落的作用下系统实现水解-反硝化脱氮目标。这说明木屑在反硝化滤池中既是微生物生长富集的介质，也可以稳定释放碳源。运行条件的改变对碳源释放的速率不产生影响，木屑释放的碳源与异养反硝化过程消耗的碳源基本持平，出水中无过量残留的碳源物质，木屑-硫磺异养自养联合反硝化工艺不会对二级出水造成次生污染。
图6 出水COD变化
2.5 pH的变化
反应器自启动之后的pH变化如图7所示。在反应器运行的前16 d内，出水pH较高，最高为7.58。此时木屑释放大量碳源，异养反硝化速率大于自养反硝化，反应器内部异养反硝化在异养自养联合反硝化中所占的比重大于硫自养反硝化，产生的碱度大于消耗的碱度。第16 天之后，出水pH基本趋于稳定，均在6.9~7.4的范围内，出水呈中性。这是由于反应器内部以木屑为缓释碳源的异养反硝化过程所产生的碱度与硫自养反硝化所消耗的碱度相当。自第28 天开始，pH略有下降，最低降至6.97。说明此时硫自养反硝化所占比例加大，而这一阶段硫酸盐的生成量又呈现下降的态势，可能是反应器中硫酸盐还原菌将部分硫酸盐转化成H2S的缘故。在运行56 d之内，反应器出水pH未产生较大的波动，说明木屑-硫磺填充床反硝化生物滤池在运行过程中无需外加碱类物质。
图7 pH随时间的变化
3 结论
1)木屑释放碳源的速率在前10 d内逐渐下降，所释放的碳源物质中VFA浓度最高达到120.1 mg・L−1，乙酸在COD中所占比例最高达61.0%。而后木屑释放碳源速率趋于稳定，COD中(40.6±10.0)%为微生物可直接利用的VFA。30 d内木屑均能稳定释放VFA，木屑可以作为异养反硝化的碳源物质。
2)木屑-硫磺填充床反硝化生物滤池运行的最佳HRT为10 h。反应器在此条件下对30 mg・L−1的NO3−-N有着较好的去除效果，出水硝酸盐浓度最低为11.5 mg・L−1，亚硝酸盐浓度最低为1.4 mg・L−1。在木屑-硫磺填充床反硝化生物滤池内未发生硝酸盐异化还原(DNRA)作用，出水无氨氮积累。
3)出水SO42−浓度最高为73.8 mg・L−1。HRT=10 h时硫酸盐的积累量与HRT=12 h时相差不大，低于其他HRT条件的积累量。可确定反应器最佳水力停留时间为10 h。不同阶段硫自养反硝化占比分别为(54.9±1.3)%(Ⅰ)、(48.2±1.2)%(Ⅱ)、(41.1±0.8)%(Ⅲ)、(41.2±1.2)%(Ⅳ)。反应器中可能存在硫酸盐还原菌，使得硫酸盐生成量逐渐下降。
4)反应器启动后出水COD逐渐下降，运行稳定后出水COD未超过30 mg・L−1，木屑释放的碳源与反硝化过程消耗的碳源实现平衡，不会造成碳源过剩现象的产生，出水中无过量残留有机物。出水pH在6.9~7.4的范围内，呈中性，无需外加碱类物质。(来源：环境工程学报 作者：董全宇)
作为生物膜法处理技术之一, 生物滤池在污水处理领域已有不少应用, 如工厂化水产养殖用到的各种生物包, 低污染源水的深度处理, 以及与其它水处理工艺的耦合等.在城市污水处理方面, 生物滤池常用于污水深度脱氮, 一般是强化硝化-反硝化, 对应的构筑物有曝气生物滤池、反硝化滤池等.曝气生物滤池是目前研究和应用较多的一种, 有关其净化机制、效能评价、参数优化、技术开发等研究较多.然而持续曝气的生物滤池不仅耗能高, 同时滤池内的好氧环境也不利于反硝化.为此, 研究者们又提出了间歇曝气生物滤池, 通过创造滤池内的交替好氧/厌氧(或缺氧)状态, 不仅节能, 还有利于同步脱氮除磷.
对于新启用的生物滤池而言, 挂膜所需时间长短会影响到实际生产应用.挂膜通常是指进行微生物适应性驯化, 定向培育或富集功能微生物.由于生物滤池的构筑方式、处理对象、运行环境条件等多样, 目前关于生物滤池的启动时间长短报道不一.另外, 生物滤池的净化效率不仅受控于滤料种类、填充深度、水力负荷、污染负荷、环境条件等, 还与池形(或流态)密切相关, 如硝化型曝气滤池可设计成下行流, 通过水-气对流增加氧气传质效果; 反硝化滤池可设计成折流式, 减小死水区, 增加污染物与基质的充分接触, 延长停留时间.
生物滤池的净化作用主要依赖于功能微生物, 后者又与上述影响因素密切相关.然而目前从微生物层面深入剖析滤池工况调整与净化效率的量化关系及其机制的报道较少.为了探究曝气、挂膜周期(或生物膜发育成熟度)、池形(或流态)等改变对生物滤池净化效率的影响, 本文设计了4种不同运行工况的生物滤池, 即3组垂直流滤池(MAVF、NAVF、NVF)和一组折流式水平流滤池(BHF). 4组滤池在同一环境条件下同步处理模拟配制的生活污水, 通过各组滤池净化效率的比较及微生物群落结构解析, 明确滤池净化效率与上述影响因素的量化关系, 以期为实际生产应用提供理论指导.
1 材料与方法1.1 试验系统设计与构建
试验构建的4组生物滤池框架均为有机玻璃, 其中3组垂直流滤池规格一致, 即L×W×H为48 cm×48 cm×60 cm, 水平流滤池为100 cm×48 cm×48 cm, 水平流滤池内还设置了9个等间距平行交错的折流板(39 cm×0.9 cm×48 cm). 4组滤池内均填充孔径3~5 mm、孔隙率为0.433的多孔陶粒; 垂直流、水平流滤池填充深度分别为38、34 cm.曝气滤池安装了曝气系统, 具体在曝气滤池底部铺设PVC布气管, 布气管直径20 mm, 表面钻有间距5~8 mm、大小5~6 mm的出气孔; 布气管内穿插纳米微孔曝气管(内径×外径=10 mm×15 mm), 后者通过聚乙烯软管(内径×外径=10 mm×13 mm)与旋涡风机相连(风量：60 m3・h-1; 最大风压：10 kPa; 品牌：亚士霸; 型号：HG-250;产地：浙江台州).运行时, 污水经水泵抽提后通过垂直流滤池表面的布水管流入滤池内, 其中MAVF滤池出水流入BHF滤池, 而NAVF和NVF滤池出水直接外排.各组滤池底部或末端装有出水阀, 用于调控滤池排水(图 1).
图 1
1.2 滤池运行与数据采集
本试验开始之前, MAVF、BHF滤池已于前期运行1 a, 主要用于处理模拟配制的高浓度养殖废水[9], 滤池内已形成成熟的生物膜; 而NAVF、NVF为新启用滤池.试验启动时, 于各组滤池内接种采自武汉某污水处理厂生化池末端的活性污泥, 每天接种1次, 连续接种3 d.过后, 再往滤池内引入模拟配制的生活污水进行挂膜/微生物驯化, 并开始采集数据, 期间MAVF、NAVF滤池进行曝气, 其余未曝气.生活污水的配制参考该污水厂沉砂池的出水.生活污水的配制方案如下：每升水含面粉、葡萄糖(含少量钠、钙、铁、锌等元素)、碳酸氢铵、磷酸二氢钾的质量依次为0.30、0.15、0.225 6和0.043 9 g.配制废水对应各项污染物的质量浓度见表 1.
表 1 试验模拟配制的废水组成1) /mg・L-1
目前关于生物滤池启动时间长短尚无定论, 如张菊萍等采用接种挂膜方式, 在平均水温为16.7℃时, 仅需17 d就可以实现曝气生物滤池成功挂膜; 王建华等考察了进水是否含有机物对硝化型曝气生物滤池挂膜的影响, 发现进水不含有机物的滤池成功挂膜仅需18 d, 而进水含有机物的滤池成功挂膜需24 d; 端艳等称悬浮陶粒曝气生物滤池处理城镇污水的自然挂膜启动时间为23 d; 王东等[2]比较了沸石和陶粒填料曝气生物滤池处理微污染水源水的低温启动特性, 在水温为10~14℃的启动条件下, 均可在30 d内完成接种挂膜.本研究将新滤池挂膜时间设定为一个月, 期间将各组垂直流滤池水力负荷设为0.05、0.10、0.18 m3・(m2・d)-1这3个水平, 每个水平持续运行10 d.
3组垂直流滤池每天间歇进水1次, 其中MAVF出水即为BHF进水.曝气滤池每天间歇曝气6 h, 即上午09:00~12:00、下午14:30~17:30;对应3种水力负荷的气水比约为1 200：1、600：1和300：1.水样采集点为滤池进、出水, 采样频率为每天1次.采用美国YSI多参数水质分析仪(型号：Pro Plus)现场测定温度(T)、溶解氧(DO)、氧化还原电位(ORP)、碱度(pH)、电导率(Cond)、比电导率(SC)、总溶解固体(TDS)、盐度(Sal)等在线参数.水样采集后, 按国家标准方法[10]测定COD、TN、NO3–N、NO2–N、TAN、TP、IP等指标, 其中COD为高锰酸盐指数. COD又分为总有机物(TCOD)和溶解性有机物(DCOD). DCOD为水样经0.45μm滤纸过滤后测定值, TCOD为直接测定值.
挂膜结束后, 采集各组滤池陶粒样品送杭州联川生物技术股份有限公司进行微生物检测, 具体是通过16S rDNA高通量测序方法完成微生物群落结构分析.测序平台为MiSeq, 采用细菌16S rDNA V3+V4区域通用引物：338F ACTCCTACGGGAGGC AGCAG和806R GGACTACHVGGGTWTCTAAT.下机原始数据利用overlap将双端数据进行拼接, 并进行质控、嵌合体过滤以获得高质量的有效数据, 随后对其进行97%的相似度聚类.为了降低假阳性率, 过滤singleton序列以获得最终的OTU丰度及代表序列.
1.3 数据分析
生物滤池的净化效率除受污染负荷影响外, 还与滤料类型、填充深度密切相关, 后者会影响到构建成本.为了综合多方面因素, 本文采用去除率和一阶去除率常数k来评价滤池的净化效能, 即：
式中, k为一价去除率常数, d-1; HLR为水力负荷, m・d-1; ci、ce分别为进、出水污染物质量浓度, mg・L-1; hw为基质填充深度; ε为孔隙率.
采用独立t-test检验各组滤池进出水间理化特征的差异.因为BHF滤池进水即为MAVF出水, 为了屏蔽进水浓度对滤池净化效率的影响, 以进水污染负荷为协变量, 采用协方差分析比较各组滤池间净化效率的差异.此外, 为了比较各组滤池微生物群落结构及净化效率的相似性, 采用层次聚类法对优势菌种的相对丰度、所有OTU序列数及一阶去除率常数k进行聚类; 同时为了探究优势菌种与滤池出水理化环境特征及净化效率的关系, 还对这些变量进行了冗余度(redundancy analysis, RDA)排序分析.选择RDA是因为某些污染物指标的k值为负.排序、聚类分析分别在CANOCO 4.5、ORIGIN8.6软件中完成, 其它分析在SPSS 19.0软件中完成.
2 结果与讨论2.1 不同运行工况滤池进出水理化特征比较
由表 2可知, 4种不同工况生物滤池进出水理化参数间的差异主要体现在温度、溶解氧、氧化还原电位、碱度等指标上, 而电导率、比电导率、总溶解固体、盐度等指标的变化较小.另外, 与3组垂直流滤池相比, 水平流滤池进出水间的差异更小(仅氧化还原电位存在显著差异).进一步比较发现, 经垂直流滤池处理后, 出水温度显著升高, 溶解氧、pH显著降低.温度升高可能是因为曝气所致(鼓风机持续运行发热, 吹出的空气高于室温); 溶解氧、pH降低是因为滤池内部存在硝化过程, 需要消耗溶解氧和碱度.曝气显著提高了滤池出水溶解氧和pH(NVF出水的DO、pH分别与NAVF、MAVF出水的DO、pH相比, 所有P<0.05), 原因可能是因为硝化过程需要消耗CO2, 曝气能不断地向滤池内部输送O2和CO2, 而未曝气滤池硝化过程需要消耗原水中的CO32-或HCO3-, 后者致使pH降低.此外, 依据高立杰等提出的DO等级划分方法, 即<0.3mg・L-1代表厌氧、0.4~0.7 mg・L-1代表兼氧及>1.0mg・L-1代表好氧, 本研究4组滤池内溶解氧含量处于好氧和兼氧水平.
表 2 4组滤池进出水理化参数比较1)
2.2 不同运行工况滤池净化效能比较
由表 3可知, 4组滤池的出水硝氮、亚硝氮含量都很低(出水硝氮、亚硝氮的均值分别在0.40 mg・L-1和0.02 mg・L-1以下), 表明4组滤池内均无明显的硝氮、亚硝氮积累, 这也说明滤池内反硝化进行得很充分.相应地, 各组滤池出水中溶解性氮素以未被硝化的氨氮为主.此外, 通过比较滤池出水溶解性氮素和有机氮含量, 发现MAVF及BHF滤池出水总氮以有机氮为主, 而NAVF及NVF滤池出水总氮以溶解性氮素为主, 这可能是因为前两组滤池内生物膜相对成熟, 微生物数量丰富, 并由生物膜更新脱落所致.因此, 成熟滤池出水经沉淀处理后可进一步提高总氮去除效果.比较各组滤池的去除率, 发现3组垂直流滤池对有机物的去除率均较高, 其中TCOD的去除率都在80%以上, 但水平流滤池除对有机物/有机氮有一定的去除作用外, 对其它指标的去除率基本为负. BHF滤池对有机物、有机氮及总氮的去除率为正, 对氨氮、硝氮、亚硝氮及溶解性氮素的去除率为负, 表明滤池内发生了有机物的氨化、氨氮的硝化/亚硝化及反硝化等.同时, 由BHF滤池进出水各氮素指标的数值大小可知, BHF滤池内发生的上述氮素转化强度非常弱, 可能归结于BHF滤池内部较低的溶解氧水平.
表 3 4种不同工况滤池的进出水浓度、去除率及一阶去除率常数比较1)
3组垂直流滤池对硝氮都有较高的k值(表 3), 表明滤池内部反硝化作用较为明显, 可能是因为反硝化异养菌易于增殖, 滤池的间歇曝气运行没有对反硝化过程造成抑制.相反, 在水平流滤池中, 各项氮素指标的k值基本为负(总氮和有机氮除外), 表明水平流滤池内部的硝化-反硝化过程都受到了一定程度的抑制, 可能是因为水平流滤池没有曝气, 滤池内部的低溶解氧水平和相对不高的环境温度不利于硝化过程的进行, 进而不能为反硝化提供足够的反应底物.
方差分析结果显示, 不同工况滤池之间各项指标的k值都存在显著差异(表 3).多重比较发现, 4组滤池对碳、氮、磷的净化效率基本是MAVF>NAVF>NVF>BHF.在有机物去除方面, MAVF显著高于NAVF和NVF, 后者显著高于BHF. MAVF较NAVF的TCOD、DCOD的k值分别提高了35.2%、40.5%, 而NAVF较NVF的TCOD、DCOD的k值分别只提高了10.9%、13.3%.类似地, MAVF较NAVF的TP、IP、TAN、NO3–N、TN、DIN等k值分别提高了40.0%、33.3%、437.5%、22.8%、300.0%、385.2%, 而MAVF较NAVF的TP、IP、TAN、NO3–N、TN、DIN等k值分别只提高了25.0%、26.3%、100.0%、35.8%、120.0%、80.0%.这些增加值表明, 试验工况下滤池内碳、氮、磷的去除主要依赖于微生物的吸收和降解, 且生物膜成熟度对污染物去除的影响大于曝气.有例外曝气较生物膜成熟度对硝氮去除的影响更大, 可能是因为试验装置反硝化易于发生, 且主要受控于硝氮底物浓度, 而后者又主要来源于氨氮的氧化.此外, 各组滤池对磷的去除率均不高, 可能是因为滤池除磷仍然以生物除磷为主, 这与笔者之前报道的结果相似.具体联系污水宝或参见更多相关技术文档。
2.3 不同运行工况滤池微生物群落结构比较
4种不同工况滤池在试验末期取陶粒样品进行微生物群落结构检测, 通过16S rDNA高通量测序分析共获得96 708条有效序列, 它们在4组滤池内的分布是：MAVF(16676)、NAVF(57367)、NVF(11161)和BHF(11504).这些有效序列经聚类后共获得2 260个OTU, 它们在4组滤池内的分布是：MAVF(680)、NAVF(691)、NVF(413)和BHF(828).再依据4组滤池所含OTU序列数绘制等级丰度图和相应的α多样性指数.由样品测序稀释曲线图 2(a)可知, Chao1曲线趋于平缓, 表明测序数据量已饱和; 由图 2(b)可知, 4组滤池的辛普森指数(Simpson)一致(均为0.98), 而观察种(Observed species)、香农(Shannon)、Chao1等指数存在明显差别, 顺序都是BHF>MAVF>NAVF>NVF, 表明滤池的成熟度与微生物多样性密切相关, 即滤池愈成熟, 多样性指数愈高.
图 2
依据测序获得的特征序列进行物种注释, 4组滤池共注释到341属种微生物, 其中MAVF、NAVF、NVF、BHF的物种数分别为212、200、161、257, 这与前面描述的多样性指数变化趋势一致.此外, 将所有物种的相对丰度均列出并不便于分析, 而且优势物种往往就能反映群落结构的主要特征.因此, 本文选取丰度最高的前20个物种或功能分类, 将其余的设置为others, 进行相对丰度计算, 并据此绘制相对丰度堆叠柱状图[图 3(a)和3(b)]和物种分类热图[图 3(c)和(d)], 便于直观进行样品间物种丰度的比较.
图 3
由相对丰度堆叠柱状图可知, 在门水平上, 各组滤池的变形菌(Proteobacteria)丰度最高, 其次是拟杆菌(Bacteroidetes)和放线菌(Actinobacteria), 而厚壁菌(Firmicutes)仅在BHF中相对丰度较高.在属水平上, 相对丰度最高的是红环菌(Rhodocyclaceae_unclassified), 其余依次是黄杆菌(Flavobacterium)、纤维单胞菌(Cellulomonas)、β变形菌(β-proteobacteria_unclassified)、脱氯单胞菌(Dechloromonas)等.郭晓娅等[13]以玉米淀粉废水为反硝化碳源进行试验, 发现反应器内优势菌群中红环菌目相对丰度较大, 据此推测红环菌目可能较易于降解淀粉, 这与本研究以面粉(含淀粉)和葡萄糖为碳源进行脱氮除磷微生物富集相似.
从门水平的热图组成来看, NAVF和NVF的优势菌种组成最相似, 其中疣微菌(Verrucomicrobia)、拟杆菌、放线菌等丰度较高, 而Ignavibacteriae、绿弯菌(Chloroflexi)、硝化螺旋菌(Nitrospirae)、蓝细菌(Cyanobacteria)等丰度较低.相反, Ignavibacteriae、绿弯菌、硝化螺旋菌、蓝细菌等在BHF和MAVF中丰度较高.聚类结果显示, NAVF和NVF最相似, 而BHF与3组垂直流滤池差异最大.在属水平上, 聚类结果与门水平一致.同样, 4组滤池的优势菌种组成存在明显差别, BHF滤池中地杆菌(Geobacter)丰度最高, 而β变形菌、红环菌、伯克氏菌(Burkholderiales_unclassified)、沉积物杆状菌(Sediminibacterium)、芽殖杆菌(Gemmobacter)、脱氯单胞菌、热单胞菌(Thermomonas)等在MAVF中丰度较高.各组滤池的优势菌种相对丰度组成存在明显差别, 它们的代谢特征和主要功能注释见表 4.
表 4 图 3中优势菌种的功能注释
传统观点认为, 硝化过程属于化能自养过程, 且严格好氧.本研究通过物种注释, 于4四组滤池内仅检测到了3种专性硝化微生物, 即亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、亚硝化螺菌属(Nitrosospira)及硝化螺菌属(Nitrospira), 且三者的相对丰度都很低(表 5).这与戴琦、黄菲等报道的硝化/亚硝化菌富集低丰度结果相似.戴琦等采用膜生物反应器处理含环丙沙星(CIP)的模拟废水, 发现在0、5、10mg・L-1的CIP投加浓度下, 亚硝化单胞菌属的总相对丰度依次为0.02、0.01、0.006, 硝化螺菌属的总相对丰度依次为0.73、1.57、0.82;黄菲等研究了在冬季低温条件下, 膜生物反应器与传统活性污泥法工艺运行效果及微生物群落特征的差异, 发现R1(高污泥浓度膜生物反应器)、R2(低污泥浓度膜生物反应器)、R3(传统活性污泥工艺)中主要的硝化菌为Nitrospira, 其总相对丰度依次为1.22%、1.64%、0.15%.将上述3种自养硝化菌与表 4中前20种优势菌种按代谢功能进行合并统计, 结果见表 5.从中可知, 4组滤池内丰度最高的微生物为异养反硝化脱氮菌, 其次为异养反硝化聚磷菌, 再次为异养硝化菌.因为很多异养反硝化脱氮菌兼为异养反硝化聚磷菌和(或)异养硝化菌(表 4), 因此, 三者丰度相对较高.
表 5 4组生物滤池中自养硝化菌及优势功能菌占细菌总丰度的百分比/%
进一步分析自养硝化菌相对丰度数值, 发现NVF滤池缺乏自养硝化及亚硝化菌, BHF滤池内缺乏自养亚硝化菌, 而NAVF中缺乏自养硝化菌, 只有MAVF滤池同时含有硝化及亚硝化菌, 且MAVF滤池自养硝化菌(硝化+亚硝化菌)丰度明显高于其它3组滤池.这与2.2节观测到的MAVF滤池氨氧化作用最强, BHF滤池氨氧化作用最弱相一致. NVF及BHF滤池内的氨氧化过程均由异养菌完成, 且NVF滤池的氨氧化能力强于BHF滤池, 这是因为前者的异养硝化菌丰度明显高于后者(表 5).此外, 与两组曝气滤池(MAVF和NAVF)相比, 其余两组未曝气滤池(NVF和BHF)内均未检测到亚硝化菌, 说明曝气促进了滤池内氨氧化菌的富集.将表 5中各功能菌相对丰度与碳、氮、磷去除的k值进行相关性分析, 发现仅自养硝化菌(硝化+亚硝化菌)与氨氮、总氮及溶解性氮素之间存在显著正相关(P<0.05), Pearson相关系数分别为0.97、0.97和0.96, 这可能也暗示影响各种滤池脱氮的主要过程仍然为硝化过程, 且主要依赖于自养硝化菌.
2.4 滤池净化效能与微生物结构特征耦联分析
如2.3节所述, 将获得的2260个OTU按各自所含的序列数进行样品聚类, 结果如图 4(a)所示; 同样地, 按测定的各项污染物指标k值进行样品聚类, 结果如图 4(b)所示.由图 4可知, 两种不同途径聚类结果与丰度最高的前20个优势物种热图聚类[图 3(c)和3(d)]具有一致性, 即丰度最高的前20个优势物种基本能涵盖所有物种的聚类信息.另外, 各组滤池净化效率聚类结果与物种聚类结果一致, 这也表明滤池之间净化效率的差异主要由滤池内微生物结构差异所致.为了进一步探讨滤池净化效率与微生物群落组成的关系, 将滤池的净化效率与图 3中优势物种组成以及后者与滤池出水理化特征进行多元排序分析, 结果如图 5所示.
图 4
图 5
由各项污染物指标的k值与优势菌种的排序图 5(a)可知, 总氮、氨氮及溶解性氮素的去除具有一致性, 且与沉积物杆状菌、动胶菌(Zoogloea)、伯克氏菌、β变形菌、热单胞菌等正相关, 这是因为这些细菌兼有异养硝化和(或)反硝化功能(表 4), 而上述3种形态氮素的去除主要依赖于硝化-反硝化.沉积物杆状菌为兼性好氧异养菌, 在中性条件下的最佳生长温度为10~37℃. Papirio等以芬兰坦佩雷市某污水处理除厂活性污泥为接种物进行硝化菌的富集培养, 当流化床反应器的起始氨氮浓度为66.5~77.8mg・L-1、平均溶解氧为7.0mg・L-1时, 经过35d富集培养后于接种污泥及富集物中都检测到了优势菌属沉积物杆状菌的存在, 表明沉积物杆状菌可能具有硝化功能, 这与本研究结果相似.本研究中, 虽然沉积物杆状菌相对丰度不高(在MAVF、NAVF、NVF、BHF中的相对丰度分别为2.92、0.82、0.49、0.09), 但与自养硝化菌一样, 仍然发挥着一定的硝化功能.本研究中NVF滤池缺乏自养硝化菌, 但却发生了硝化作用, 证明了异养硝化菌的存在.此外, 排序图中有机物、磷及硝氮的去除也具有一致性, 表明磷主要通过反硝化聚磷方式去除.本研究通过16S rDNA高通量测序和物种注释并未检测到好氧聚磷菌.
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